近日，知名華人科學家張鋒教授與同事在《科學》雜志上發(fā)表論文，介紹了一種全新的CRISPR應(yīng)用工具，用以檢測核酸。他和James Collins教授團隊，聯(lián)合將CRISPR-Cas13a改造成了靈敏度達到了阿摩爾級（aM，10的負18次方摩爾每升），可以檢測單分子的SHERLOCK技術(shù)。這一工具能快速檢測RNA或DNA分子，靈敏度甚至有望檢測出單個核酸，這一重磅研究對于科研與全球公共衛(wèi)生有著極大的影響，該事件很快在生物圈內(nèi)刷屏了。
就在大家在為張鋒大神歡呼雀躍，在為CRISPR-Cas13a叫好的時候。我們發(fā)現(xiàn)，讓SHERLOCK技術(shù)達到阿摩爾級靈敏度的不是CRISPR-Cas13a，是它的搭檔，另一個顛覆性的發(fā)明重組聚合酶擴增技術(shù)（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）。很少有報道提起她，她就那樣默默站在CRISPR-Cas13a背后。
RPA有多厲害？據(jù)說可以媲美PCR技術(shù)。什么是PCR？著名發(fā)明家Kary Mullis因為發(fā)明這個技術(shù)于1993年獲得諾貝爾獎。RPA技術(shù)被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)（由英國公司TwistDx Inc開發(fā)）。以此為基礎(chǔ)的TwistAmp? 核酸擴增產(chǎn)品，能夠在15分鐘內(nèi)進行常溫下的單分子核酸檢測。該技術(shù)對硬件設(shè)備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。如果張鋒和Collins教授的這項發(fā)明最終能造福人類，我們也應(yīng)該記住RPA的發(fā)明人。
常規(guī)的PCR也可以擴增特定DNA片段，提高靈敏度，但是PCR對溫度的控制有很復(fù)雜的要求，要經(jīng)歷高溫變性、低溫復(fù)性還有中溫延伸三個步驟。RPA就不需要這么麻煩，它的反應(yīng)需要三種在常溫下有活性的酶，最適溫度在37-42℃之間，不需要變性過程，這樣就大大加快了擴增的速度。再加上不需要溫控設(shè)備，兩者共同打造了真正便攜式的快速DNA擴增技術(shù)。
不僅方便快捷，RPA更“迷人”的地方在于擴增量十分高，能夠?qū)⒑哿康暮怂幔ㄓ绕涫荄NA）模板擴增到能夠可以檢測到的水平。痕量，顧名思義就是“該物質(zhì)雖然存在，但只有‘痕跡’，無法用一般方法定量檢測，通常含量＜0.1mg”，所以大家就知道RPA有多厲害了吧？利用它可以從單分子得到大約1012的擴增產(chǎn)物。而且RPA還不需要復(fù)雜的樣品處理，及時環(huán)境限制，無法提取核酸，也難不倒它[4]。
利用RPA，在室溫中，樣品中DNA或RNA的含量就可以得到提升，一旦含量增加了，再將DNA轉(zhuǎn)化為RNA。如此，Cas13a就有資格進化成“SHERLOCK”了！
RPA技術(shù)答疑
▲RPA技術(shù)有哪些特性？
RPA的特性：快速檢測 15min進行單分子檢測試驗， 簡易包裝 穩(wěn)定凍干形式試劑. 無需熱循環(huán)過程 擺脫任何儀器束縛. 便攜 設(shè)備要求低，貧瘠條件亦能 完成檢測
▲RPA能實現(xiàn)多重化嗎？
可以。RPA技術(shù)支持在同一個管中同時進行多個擴增反應(yīng)。不過，多重化的引物組合需要精心設(shè)計，以便每個引物都能同樣有效的工作。需要注意的是，RPA反應(yīng)的引物總量(nmol)最好不要超標太多。如果在一個反應(yīng)中使用兩個以上的擴增引物，就應(yīng)該控制不同引物的量。另外，我們應(yīng)當事先考慮好檢測多個擴增事件的探針、設(shè)備以及熒光團的兼容性。
▲能否對模板進行定量？
可以。擴增子達到可檢出水平的時間，依賴于反應(yīng)起始時的模板量。初始模板的拷貝越多，擴增子就越快達到可檢出水平。不過，這種定量需要精心的實驗安排，確保對照反應(yīng)是同時開始的。舉例來說，可以利用鎂離子的添加時間進行控制。因為鎂離子一旦進入體系，RPA反應(yīng)就會開始。
此外，較慢的擴增過程有助于更精確的定量。我們可以通過調(diào)整反應(yīng)條件或引物設(shè)計來減慢RPA的反應(yīng)速度。
▲能否進行熒光終點分析？
可以。這樣比較的是反應(yīng)開始時的熒光和反應(yīng)結(jié)束時的熒光，熒光增強意味著發(fā)生了擴增。
▲能否支持生物素或熒光標記的寡核苷酸？
支持。在RPA反應(yīng)中，連有生物素或熒光團的引物與未修飾的引物表現(xiàn)差不多。據(jù)悉還沒有發(fā)現(xiàn)任何差異。
▲跑膠前需要回收RPA產(chǎn)物嗎？
需要。RPA反應(yīng)中的物質(zhì)會干擾瓊脂糖電泳，如果不進行產(chǎn)物回收，跑出來的帶會出現(xiàn)拖尾。
RPA核酸檢測系列最新應(yīng)用
犬內(nèi)臟利什曼病POCT檢測 A Novel Molecular Test to Diagnose Canine Visceral Leishmaniasis at the Point of Care A Castellanos-Gonzalez, O.A. Saldarriaga, L. Tartaglino, R. Gacek, E. Temple, H. Sparks, P. C. Melby, B.L Travi Prduct used：TwistAmp nfo kit Paper Link： http://www.ajtmh.org/content/early/2015/07/30/ajtmh.15-0145.abstract
RPA用于全基因組和基因特異性DNA甲基化檢測 Colorimetric detection of both total genomic and loci-specific DNA methylation from limited DNA inputs Eugene J.H. Wee, Thu Ha Ngo, Matt Trau Prduct used：TwistAmp basic kit Paper Link： http://www.clinicalepigeneticsjournal.com/content/7/1/65 埃及血吸蟲病RPA擴增及寡色譜測流試紙檢測 Isothermal Recombinase Polymerase amplification (RPA) of Schistosoma haematobium DNA and oligochromatographic lateral flow detection A. Rosser, D. Rollinson, M. Forrest, B. L Webster Prduct used：TwistAmp basic kit；TwistAmp nfo kit Paper Link： http://www.parasitesandvectors.com/content/pdf/s13071-015-1055-3.pdf
