“Thistechnology has the potential to revolutionize low-cost,nucleic acid-based rapid testing.”  

——Rice University

      德國研究人員已利用 RPA 開發出一種自動 DNA 擴增和化學發光微陣列平臺，該平臺可以同時識別并定量水中的多種病毒和細菌污染物。

      這一多重技術是對一種名為 MCR 3（第三代微陣列芯片讀取器）的導流裝置的改造，由Michael Seidel 博士在慕尼黑工業大學 (TUM) 水化學研究所（負責教授：Niessner 博士）2研發。研究團隊最初設計了基于流的 MCR 3 系統，用于食品和水安全檢測中的自動免疫分析工作。RPA（用于恒溫 DNA 擴增）與HRP 標記鏈霉親和素（用于在同一芯片上進行化學發光檢測）的潛在結合，為便攜式實地水檢測系統的開發帶來了諸多機會。

      研究團隊重建了裝置的芯片加載單元，納入了一個可控的熱電加熱模塊，并加入了一個雜交盒3。Seidel 博士指出：“37-40°C 的 RPA 工作溫度對于導流微陣列而言十分理想。正是 RPA 的這一關鍵特征，使我們能夠在芯片上實現擴增。其他恒溫擴增技術需要的溫度更高，這可能會使芯片上的水蒸發，從而破壞實驗或損壞微陣列。RPA 是我們所知的最有望直接在 DNA 微陣列上操作的方法。”

        TUM 團隊開發出的方法包含固相和液相擴增。空間上分離的、未標記的各病原體特異性反向引物點直接顯現到芯片表面上。生物素標記的正向引物、未標記的反向引物和 RPA 試劑被添加到微陣列表面上方的液相中。生物素化的擴增產物會在反應期間直接在芯片上合成產生，也會形成體相，并雜交成固相化引物。團隊稱，這一雙重擴增循環提高了分析的靈敏度。試劑流是單向的，所需的射流元件最少 — 理論上只要一個閥門和一個注射泵即可。HRP 鏈霉親和素與生物素標記結合，使化學發光檢測成為可能。

       對平臺進行測試時，研究團隊首先開展試驗檢測單一微生物，然后再檢測同一芯片上的多種微生物，具體方法為對以下每種病菌或病菌組合添加帶有 DNA 模板的水樣本。這些病菌有：水生細菌性和病毒性病原體、41 型人腺病毒 (HAdV 41)、糞腸球菌以及大腸桿菌噬菌體 Phi X 174。研究人員也成功使用了來自培養提取物的基因組 DNA。HAdV 41、Phi X 174 和糞腸球菌的檢出限 (LOD) 分別為 35 個基因組單位(GU)/μL、1 GU/μL 和 5 x 103 GU/μL。據作者介紹，這與 qPCR 分析報告的靈敏度相當，但分析時間大大縮短。

      研究人員在其發表的論文 Analytical Chemistry（《分析化學》）中總結道：“由于擴增是針對每個點上的一種靶標病原體單獨進行，因此可以將開發的檢測方法改良為多重檢測方法。病原體通過其在微陣列中的點位識別，而化學發光強度則與樣本中的病原體 DNA 數量相關聯。”

      自論文發表以來，TUM 研究人員已將其平臺打造成一個便攜式微陣列，用于檢測從冷卻塔或空調系統中提取的濃縮水樣本中的軍團菌。目前平臺正處于驗證測試階段。Seidel 博士強調：“我們的目的是讓這一技術不需要太多培訓就能夠為人們所用。整個過程自動進行，并且十分簡單。未來我們希望開發出一個應用廣泛的水衛生監測平臺，能同時檢測工業水和飲用水濃縮樣本中的 10 到 15 種不同的細菌和病毒污染物。”

參考文獻：

1 Kunze,A.; Dilcher, M.; Abd El Wahed, A.; Hufert, F.; Niessner, R. and Seidel, M.,On-Chip Isothermal Nucleic Acid Amplification on Flow-Based ChemiluminescenceMicroarray Analysis Platform for the Detection of Viruses and Bacteria.Analytical Chemistry 2016, 88, 898–905. DOI:10.1021/acs.analchem.5b03540.
2 Seidel, M. and Niessner, R., Chemiluminescence microarrays: a criticalreview. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2014,406, 5589–5612,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25002333
3 Lengger, S.; Otto, J.; Elsaesser, D.; Schneider, O.; Tiehm, A.;Fleischer, J.; Niessner, R.; Seidel, M., Oligonucleotide microarray chip forthe quantification of MS2, PhiX174, and adenoviruses on the multiplex analysisplatform MCR 3. Analytical Bioanalytical Chemistry 2014, 406, 3323-3334,link.springer.com/article/10.1007%2Fs00216-014-7641-y. 

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