TwistDx公司RPA恒溫擴(kuò)增技術(shù)被譽為DNA診斷領(lǐng)域的革命性創(chuàng)新
作者：moreybio 發(fā)布時間：2017-04-06 點擊次數(shù)：10676
英國TwistDx公司(前身為ASM科技有限公司)成立于1999年，基于英國劍橋Babraham研究院建立的生物技術(shù)公司。該公司通過突破等溫DNA擴(kuò)增，開發(fā)的重組酶聚合酶擴(kuò)增專利技術(shù)(RPA),被譽為DNA診斷領(lǐng)域的革命性創(chuàng)新。(http://www.twistdx.co.uk)
What is RPA?
概念：重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)。RPA技術(shù)主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應(yīng)溫度在37°C左右。
重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動DNA合成，對模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。被替換的DNA鏈與SSB結(jié)合，防止進(jìn)一步替換。在這個體系中，由兩個相對的引物起始一個合成事件。整個過程進(jìn)行得非常快，一般可在十分鐘之內(nèi)獲得可檢出水平的擴(kuò)增產(chǎn)物。
Who uses RPA?
以此為基礎(chǔ)的TwistAmp? 核酸擴(kuò)增產(chǎn)品，能夠在15分鐘內(nèi)進(jìn)行常溫下的單分子核酸檢測該技術(shù)對硬件設(shè)備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 儲存 | 檢測方法 |
TwistAmp Basic | TABAS03KIT | 96次 | -20℃ | 終點檢測：如凝膠電泳 |
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 儲存 | 檢測方法 |
TwistAmp exo | TAEXO02KIT | 96次 | -20℃ | 實時熒光定量檢測 |
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 儲存 | 檢測方法 |
TwistAmp nfo | TANFO02KIT | 96次 | -20℃ | 測流層析試紙檢測 |
RPA技術(shù)有哪些特性:
RPA的特性：快速檢測 15min進(jìn)行單分子檢測試驗， 簡易包裝 穩(wěn)定凍干形式試劑. 無需熱循環(huán)過程 擺脫任何儀器束縛. 便攜 設(shè)備要求低，貧瘠條件亦能 完成檢測
RPA能實現(xiàn)多重化嗎
可以。RPA技術(shù)支持在同一個管中同時進(jìn)行多個擴(kuò)增反應(yīng)。不過，多重化的引物組合需要精心設(shè)計，以便每個引物都能同樣有效的工作。需要注意的是，RPA反應(yīng)的引物總量(nmol)最好不要超標(biāo)太多。如果在一個反應(yīng)中使用兩個以上的擴(kuò)增引物，就應(yīng)該控制不同引物的量。另外，我們應(yīng)當(dāng)事先考慮好檢測多個擴(kuò)增事件的探針、設(shè)備以及熒光團(tuán)的兼容性。
能否對模板進(jìn)行定量
可以。擴(kuò)增子達(dá)到可檢出水平的時間，依賴于反應(yīng)起始時的模板量。初始模板的拷貝越多，擴(kuò)增子就越快達(dá)到可檢出水平。不過，這種定量需要精心的實驗安排，確保對照反應(yīng)是同時開始的。舉例來說，可以利用鎂離子的添加時間進(jìn)行控制。因為鎂離子一旦進(jìn)入體系，RPA反應(yīng)就會開始。
此外，較慢的擴(kuò)增過程有助于更精確的定量。我們可以通過調(diào)整反應(yīng)條件或引物設(shè)計來減慢RPA的反應(yīng)速度。
能否進(jìn)行熒光終點分析
可以。這樣比較的是反應(yīng)開始時的熒光和反應(yīng)結(jié)束時的熒光，熒光增強意味著發(fā)生了擴(kuò)增。
能否支持生物素或熒光標(biāo)記的寡核苷酸
支持。在RPA反應(yīng)中，連有生物素或熒光團(tuán)的引物與未修飾的引物表現(xiàn)差不多。據(jù)悉還沒有發(fā)現(xiàn)任何差異。
跑膠前需要回收RPA產(chǎn)物嗎
需要。RPA反應(yīng)中的物質(zhì)會干擾瓊脂糖電泳，如果不進(jìn)行產(chǎn)物回收，跑出來的帶會出現(xiàn)拖尾。
恒溫擴(kuò)增技術(shù)
取代PCR的核酸擴(kuò)增術(shù) ，
領(lǐng)域：廣泛應(yīng)用于臨床診斷，食品安全檢測，動物疾病檢測等領(lǐng)域
特點：快速，高效，特異，無需專門設(shè)備
RPA與LAMP對比
LAMP:環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法的特征是針對目標(biāo)DNA鏈上的六個區(qū)段設(shè)計四個不同的引物然后再利用鏈置換反應(yīng)在一定溫度下進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)只需要把基因模板、引物、鏈置換型DNA合成酶、基質(zhì)等共同置于一定溫度下(60～65℃)、經(jīng)一個步驟即可完成。
RPA：主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。
重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動DNA合成，對模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。被替換的DNA鏈與SSB結(jié)合，防止進(jìn)一步替換。在這個體系中，由兩個相對的引物起始一個合成事件。
LAMP | RPA | ||
開發(fā)公司 | 日本榮研生物 | 英國TwistDx | —— |
酶組分 | 鏈置換DNA聚合酶 | 重組酶;單鏈結(jié)合蛋白;鏈置換DNA聚合酶 | —— |
最適反應(yīng)溫度 | 60-65℃ | 37-40℃ | Win! |
反應(yīng)時間 | 40min左右 | 15min左右 | Win! |
引物數(shù) | 2對 | 1對 | Win! |
狀態(tài) | 液體 | 凍干 | Win! |
檢測方式 | 目視;比濁檢測 | 電泳;測流試紙;探針法熒光定量 | —— |
可否用于下游應(yīng)用 | 否 | 否 | —— |
儀器 | 水浴鍋或恒溫箱 | 無需任何儀器 | Win! |
國產(chǎn)化，價格低 | 價格相對較高 | —— | |
硬性缺點 | 氣溶膠，假陽性 | 終端檢測相對復(fù)雜，價格高 | —— |
新一代RPA恒溫擴(kuò)增熒光檢測儀T8
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詳情請見：http://www.twistdx.com.cn/products/yqhc/64.html
可選配件（需另購）：外部電源(http://www.twistdx.com.cn/products/yqhc/65.html)，手提箱(http://www.twistdx.com.cn/products/yqhc/66.html)
RPA核酸檢測系列之RPA最新應(yīng)用
RPA核酸檢測系列之RPA最新應(yīng)用
RPA核酸檢測系列之RPA最新應(yīng)用：
犬內(nèi)臟利什曼病POCT檢測
A Novel Molecular Test to Diagnose Canine Visceral Leishmaniasis at the Point of Care
A Castellanos-Gonzalez, O.A. Saldarriaga, L. Tartaglino, R. Gacek, E. Temple, H. Sparks, P. C. Melby, B.L Travi
Prduct used：TwistAmp nfo kit
Paper Link：
 |
RPA用于全基因組和基因特異性DNA甲基化檢測
Colorimetric detection of both total genomic and loci-specific DNA methylation from limited DNA inputs
Eugene J.H. Wee, Thu Ha Ngo, Matt Trau
Prduct used：TwistAmp basic kit
Paper Link：
埃及血吸蟲病RPA擴(kuò)增及寡色譜測流試紙檢測
Isothermal Recombinase Polymerase amplification (RPA) of Schistosoma haematobium DNA and oligochromatographic lateral flow detection
A. Rosser, D. Rollinson, M. Forrest, B. L Webster
Prduct used：TwistAmp basic kit；TwistAmp nfo kit
Paper Link：
更多RPA相關(guān)應(yīng)用請見：
產(chǎn)品詳情：
貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 描述 |
TABAS03kit | TwistAmp Basic | 用于RPA快速擴(kuò)增 |
TABSRT01KIT | TwistAmp Basic RT | 用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，CDNA快速擴(kuò)增 |
TANFO02_T | TwistAmp nfo | 用于末端檢測，檢測DNA復(fù)制反應(yīng) |
TAFPG01kit_T | TwistAmp fpg | 用于real-time探針檢測 |
TAEXO02kit_T | TwistAmp exo | 用于real-time探針檢測 |
TAEXORT02kit_T | TwistAmp exo RT* | 熒光檢測探針法RT-RPA |
TAUST01kit | TwistAmp exo +Listeriam | 用于李斯特菌檢測 |
TAEXOCAMP01KIT | TwistAmp exo +Campylobacter | 用于彎曲菌檢測 |
TFSAL01KIT_T | TwistFlow Salmonella | 用于沙門螺桿菌檢測 |
TGSAL01KIT_T | TwistGlow Salmonella | 用于沙門螺桿菌檢測 |
TFRED01KIT_T | TwistFlow RedSnapper | 用于紅鯛魚基因檢測 |
