Western blot(蛋白印跡)作為科研研究中最為平常的實(shí)驗(yàn)，卻蘊(yùn)含了很多知識(shí)，可謂是小實(shí)驗(yàn)里卻有大文章。盡管絕大多數(shù)研究僧在接觸該實(shí)驗(yàn)時(shí)都會(huì)被虐的體無完膚，卻也在和WB斗志斗勇的過程中積累了不少經(jīng)驗(yàn)。正所謂前人種樹，后人乘涼，現(xiàn)在小魚就把各位前輩做WB的各種經(jīng)驗(yàn)總結(jié)起來，希望對(duì)大家能有所幫助。
WB的基本原理
在電場(chǎng)的作用下將電泳分離的多肽從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測(cè)，經(jīng)常用于目的蛋白的表達(dá)特性分析、組織定位、表達(dá)量分析及與其他蛋白的互作。依其原理，可分為兩種方法：A、直接法和B、間接法。
經(jīng)驗(yàn)總結(jié)：
1：合適的鹽濃度下，保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。
2：盡量除去核酸，多糖，脂類等干擾分子
3：提取蛋白質(zhì)過程中，應(yīng)在低溫環(huán)境下進(jìn)行，以抑制蛋白酶的水解作用（可加入適合的蛋白酶抑制劑）。
4：蛋白樣品建議分裝后冷凍干燥或直接以液體態(tài)置-80℃中保存，不要反復(fù)凍融。
5：蛋白濃度低時(shí)，可使用超濾膜濃縮或者用真空凍干機(jī)將蛋白凍干。
經(jīng)驗(yàn)總結(jié)：
1：上樣時(shí)：根據(jù)蛋白表達(dá)豐度調(diào)整蛋白上樣量，盡量保證每孔上樣量保持一致。
2：膠最好現(xiàn)配現(xiàn)用，如果需要保存，最好用濕潤(rùn)的保鮮膜包好并置于4℃冰箱中。
3：為了檢測(cè)整個(gè)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)或校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需要設(shè)置內(nèi)參（一般指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白）。
4：為了確保western blot結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性，設(shè)置合適正確的對(duì)照是必不可少，一般需要設(shè)置的對(duì)照如下——
陽(yáng)性對(duì)照：明確表達(dá)檢測(cè)蛋白的組織或細(xì)胞，用于檢測(cè)抗體的工作效率；
陰性對(duì)照：明確不表達(dá)檢測(cè)蛋白組織或細(xì)胞，用于檢測(cè)抗體的特異性；
二抗對(duì)照：不加一抗，用于檢測(cè)二抗的特異性；
內(nèi)參對(duì)照：檢測(cè)標(biāo)本的質(zhì)量和二抗系統(tǒng)
空白對(duì)照：不加一抗和二抗；用于檢測(cè)膜的性質(zhì)和封閉的效果。
用于western blot的雜交膜主要有兩種：NC膜和PVDF膜，可依據(jù)目的蛋白與膜的結(jié)合能力及膜的孔徑來挑選不同的轉(zhuǎn)移膜。
兩個(gè)膜之間的比較：
轉(zhuǎn)膜方法：分為兩種濕轉(zhuǎn)法和半干法
經(jīng)驗(yàn)總結(jié)：
1：膠在負(fù)極，膜靠近正極；濾紙不要大過膜，防止短路；
2：夾好膜和凝膠后，確定在凝膠、膜和濾紙之間沒有氣泡存在，否則會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不完全。
3：注意一定要戴手套或塑料鑷子接觸膜，避免手上的蛋白和油脂降低轉(zhuǎn)膜效率。
4：轉(zhuǎn)膜過程中，尤其是高電流快速轉(zhuǎn)膜時(shí)，通常 會(huì)有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，最好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。
5：對(duì)于濕轉(zhuǎn)法：一般轉(zhuǎn)膜的電流在200mA-400mA之間，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過夜。大片段的>50KD的可以選用350mA,小片段的可以用250mA。具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng)，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。
經(jīng)驗(yàn)總結(jié)：
1：常見的封閉液有5%脫脂奶粉、BSA和Western Blot膜封閉液（生物試劑公司提供）。但是封閉液的選取具體得看抗體說明書，有的抗體是明確要求只能用BSA，而封閉液濃度的選擇也是具體得看抗體的要求，但是一般情況5%BSA會(huì)比5%牛奶的效果好。
2：選擇抗體時(shí)，一方面需要考慮所選抗體是否能識(shí)別凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至膜上的變性蛋白，另一方面需要考慮所選抗體是否會(huì)引起交叉反應(yīng)條帶。
WB做完后，有時(shí)需要對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量。然而最備受推崇的定量分析軟件Quantiy One軟件因其高昂的售價(jià)令很多人望而卻步，但除了該軟件外還有一個(gè)比較簡(jiǎn)單的圖像處理軟件ImageJ可以很方便的進(jìn)行灰度和密度分析。
ImageJ的軟件界面
1.ImageJ對(duì)WB條帶進(jìn)行灰度分析
1）File|Open打開WB結(jié)果圖片
2）圖片類型設(shè)置：Image|Type|8bit
3）去除圖片背景：Process|Subtract Background
在Subtract Background窗口按照以下條件進(jìn)行設(shè)置：
4）設(shè)置定量參數(shù)：Analyze |SetMeasurements,點(diǎn)擊Area，Mean Gray Value及Integrated Density
5）設(shè)置單位: Analyze|SetScale,在“unit of length”的方框里輸入“pixels”
6）將圖片轉(zhuǎn)換成亮帶，Edit|Invert
7）選擇Freehand Selection,盡量把條帶圈起來，點(diǎn)擊鍵盤m，出來IntDen灰度值
8）復(fù)制數(shù)據(jù)IntDen進(jìn)行分析
2. Image J 對(duì)WB條帶進(jìn)行密度分析
1）步驟同前，F(xiàn)ile|Open打開WB結(jié)果圖片
2）如果條帶不正，需修正
Image transform rotate調(diào)節(jié)angle值，直到條帶水平為止
3）選中矩形選項(xiàng)，圈中第一個(gè)條帶，AnalyzeGels Select Firstlane（快捷鍵Ctrl +1），然后移動(dòng)第一個(gè)條帶上的矩形到第二個(gè)條帶上，Analyze Gels Select Second Lane（快捷鍵Ctrl+2）,最后Analyze GelPlotlanes
選中直線工具，將開口的波峰關(guān)閉
選中魔棒工具，點(diǎn)擊波峰可以顯示波峰下面積，即條帶的密度值
以第一個(gè)數(shù)值為基數(shù)，其他數(shù)值與第一個(gè)數(shù)值的比值即為相對(duì)密度。
另附前輩們11條“濟(jì)世”經(jīng)驗(yàn)
1、抽提出某個(gè)蛋白第一次檢測(cè)，因?yàn)椴恢辣磉_(dá)量咋樣，可以減少裂解液（這樣蛋白濃度高一些），上樣量加大，抗體濃度大一點(diǎn)，增加出結(jié)果的幾率，否則出不來結(jié)果不知道是因?yàn)榈鞍琢刻∵€是抗體等其他條件影響，有結(jié)果后再根據(jù)條帶的亮度調(diào)整各種試劑的用量。
2、同時(shí)檢測(cè)兩種蛋白或兩個(gè)樣本的同種蛋白時(shí)，蛋白抽提出來后測(cè)濃度，調(diào)整每個(gè)孔的蛋白上樣量一致，通常做法時(shí)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，再計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度，下面是偷懶的辦法：直接用酶標(biāo)儀測(cè)這兩個(gè)樣品的吸光度，根據(jù)吸光度值將兩個(gè)樣品的蛋白濃度調(diào)整成一致后上樣。吸光度跟蛋白濃度成正比，沒必要一定要測(cè)量出具體濃度，而且只要使我研究的一對(duì)蛋白濃度調(diào)整一樣（對(duì)照組，處理組），沒必要將不同樣本的各組均調(diào)節(jié)成一個(gè)濃度。（懶人有懶人的活法，但是我懶得有原則）
3、科研小白注意黑膠白膜，黑膠白膜，黑膠白膜，重要的事情說三遍。轉(zhuǎn)膜是最好是將膜放在下面，膠放上面，否則會(huì)有鏡像效果，等轉(zhuǎn)完膜后拿出膜時(shí)，把膜反過來時(shí)，上樣順序會(huì)左右顛倒，因?yàn)槟z無正反，膜有正反。
4、marker盡量不要放在中間，放在兩邊作為順序的標(biāo)記，或者，在膠剝離出來后和PVDF膜的一角剪掉一小塊作為標(biāo)記。（翻過來翻過去，咦，記不得哪邊是哪邊了）
5、封閉的時(shí)間可以延長(zhǎng)問題不大，但是跑膠電泳時(shí)不能將膠長(zhǎng)時(shí)間放在儀器里面，而應(yīng)該放在轉(zhuǎn)膜液里固定（里面有甲醛，可固定蛋白），如果在沒有電流下蛋白一直在膠內(nèi) ，蛋白未被固定，會(huì)擴(kuò)散，轉(zhuǎn)完膜后條帶難看。（甲醛是什么呀，就是大家經(jīng)常報(bào)道的新裝修的房子甲醛超標(biāo)，所以實(shí)驗(yàn)狗不容易呀，每天跟這些有毒的東西打交道。）
6、封閉不一定要使用脫脂牛奶，3%BSA也可以，做磷酸化蛋白是盡量使用BSA可以降低背景。一般的實(shí)驗(yàn)還是用便宜的脫脂牛奶。
7、如果一次性需要檢測(cè)多個(gè)蛋白，電泳后可根據(jù)marker（即分子量）將膜剪開，分別不同的抗體孵育，可一次檢測(cè)多個(gè)蛋白；當(dāng)兩個(gè)蛋白分子量很相近PVDF膜無法剪開時(shí)，可先曝表達(dá)弱的蛋白，再用抗體洗脫液將已結(jié)合的一抗、二抗洗去，這樣一張印跡膜可以多次使用，再曝表達(dá)強(qiáng)的蛋白，但注意的是此種方法可由于劇烈處理丟失某些表位。
8、買一個(gè)抗體孵育槽可以節(jié)省抗體的使用量，每個(gè)小槽可以孵一張膜。（土豪請(qǐng)忽略這一條，哪里買，問淘寶）
9、內(nèi)參因?yàn)槭褂昧看螅忻嫔嫌袔RP的內(nèi)參出售（言外之意就是一抗上面就帶HRP，就不用孵二抗了），前幾次摸條件時(shí)，用帶HRP的內(nèi)參，可以直接一抗后先曝下內(nèi)參，如果內(nèi)參不齊，目的基因暫時(shí)就不用孵育了，等調(diào)節(jié)蛋白上樣量一致后再去檢測(cè)目的基因。
10、抽提蛋白時(shí)全程都要在冰上， 因?yàn)榧恿思?xì)胞裂解液后細(xì)胞被破壞，細(xì)胞內(nèi)的各種酶被釋放，如果不在冰上操作，蛋白容易降解，如果開始抽提蛋白，建議一次性操作到加上loading buffer煮蛋白變性的步驟，煮蛋白的將蛋白變性，后不易降解，如果要長(zhǎng)期保存，放到-20度。
11、頻繁做WB時(shí)，可以一次可以多配幾塊電泳膠，running buffer 4度保存，省的每次配膠。
