關(guān)于引物的問題                                                                         

PCR 引物可以用于 RPA 嗎？ 可以。我們最近已經(jīng)證實(shí)，在許多情況下，具有 PCR常用長度

（例如 18-23 個核苷酸）的引物可很好地用于 RPA。不過要注 意，反應(yīng)動力學(xué)可能會稍慢，因此如果想要發(fā)揮RPA的優(yōu)勢，在 10-15 分鐘內(nèi)快速擴(kuò)增，我們建議使用稍微長一些的引物（以及 更短的擴(kuò)增子）。此外還要注意，對于決定寡核苷酸作為 RPA 引物的因素與決定寡核苷酸作為 PCR 引物的因素兩者之間的關(guān) 聯(lián)，目前尚無正式定論。

我可以使用現(xiàn)有的 PCR  探針嗎？

不可以。大多數(shù)常用的 PCR 探針系統(tǒng)不適合用于 TwistAmp? 檢測過程。具體地說，那些利用聚合酶的 5’ 至 3’ 核酸酶活 性的系統(tǒng)不能用于 TwistAmp? 系統(tǒng)，因為這種酶活性與 RPA 生物化學(xué)過程根本不相容。

我如何設(shè)計 RPA  引物？

可以通過官網(wǎng)上附錄（網(wǎng)址為 twistdx.co.uk）中詳細(xì)介紹的篩選 過程確定好的RPA引物。

我需要使用多少引物？

TwistAmp? Basic 反應(yīng)的推薦引物濃度為每種 480nM 對于 TwistAmp? exo、TwistAmp? fpg  和 Twist Amp? nfo  試劑盒，推 薦引物濃度為每種 420nM。不過，稍微改變反應(yīng)中某些引物對 的用量可以提高其性能，可采用滴定策略（每次從 200nM 到 600nM）來確定其特定引物對的最佳濃度條件。

我如何配置凍干探針？ 請參照寡核苷酸生產(chǎn)商關(guān)于探針配置和貯存的說明。

通常，將裝有凍干寡核苷酸的小管短暫離心以使 DNA 沉降于 小管的底部，加入適量的 T0.1E   緩沖液（10mM Tris-HCI     pH 8

，0.1mM EDTA）來制備 100μM 的貯備溶液。將溶液在室溫下 靜置 10 分鐘，并混合（震蕩）10 秒鐘。配置好的寡核苷酸探 針通常可在 -20°C  下長期貯存。

我需要使用多少探針？

反應(yīng)中探針的推薦濃度為 120nM。不過，略微改變探針的濃度 有時會促進(jìn) TwistAmp? 反應(yīng)。對不同的探針濃度（從 50nM 到 150nM）進(jìn)行測試將優(yōu)化基于探針的特定檢測的性能。

RPA 引物需要多長？

為了充分利用 RPA 的檢測速度和靈敏度，我們建議客戶使用至 少 30   個核苷酸長度的引物。通常情況下，引物長度在 32   至 35 個核苷酸之間。可使用較短的 PCR 長度引物，但是這類引物 的檢測速度和靈敏度可能不及較長的引物。

RPA 引物應(yīng)當(dāng)相距多遠(yuǎn)？ 這取決于具體應(yīng)用和需求。一般而言，我們建議在標(biāo)準(zhǔn) TwistAmp? 試劑盒檢測條件下，兩個 RPA 引物產(chǎn)生的擴(kuò)增子 長度通常不應(yīng)超過大約 500bp。RPA 擴(kuò)增產(chǎn)物的大小或許沒有 下限，不過根據(jù)RPA 引物的最小長度， 擴(kuò)增子長度最小大約 80bp。為了獲得最快速的實(shí)時反應(yīng)動力學(xué)，最終擴(kuò)增子的理想長 度應(yīng)為 100-200bp。在特別優(yōu)化的情況下，生成的擴(kuò)增產(chǎn)物長達(dá) 2kb。但是，標(biāo)準(zhǔn)的 TwistAmp? 試劑盒不容易產(chǎn)生這么長的擴(kuò)增 子。請參閱附錄（網(wǎng)址為 twistdx.co.uk）了解有關(guān)引物設(shè)計和獲

得更長擴(kuò)增子方法的詳細(xì)信息。

我需要篩選多少引物？ 這取決于您對檢測靈敏度的要求。舉例來說，如果您只需要每個 反應(yīng)檢測 1000 個分子或以上，那么絕大多數(shù)引物對都夠用了。 對于極高靈敏度的檢測，最好是進(jìn)行系統(tǒng)性的引物篩選以找到 好的 RPA 引物。最初篩選時，測試的引物對數(shù)量通常在 10 到 20 對之間。測試的寡核苷酸越多，找到能夠在快速動力學(xué)下檢 測單個分子的好引物對的幾率也就越大。 我可以在哪里獲得有關(guān)引物設(shè)計的更多詳細(xì)信息？ 有關(guān)引物設(shè)計的更多詳細(xì)信息，請參閱附錄（網(wǎng)址為 twistdx. co.uk/support）

我需要使用探針篩選引物嗎？ 不需要。任何檢測方法都可以用來評估和比較候選引物對的性 能。不過，就篩選高靈敏度的引物而言，用檢測探針對擴(kuò)增進(jìn)行 實(shí)時監(jiān)控被證明是最快也是最省力的方法。

篩選引物時我應(yīng)該使用什么樣的條件？ 理論上，引物篩選的條件應(yīng)盡可能接近地模擬最終檢測時所要求 的條件（近似的模板拷貝數(shù)、樣本純度、多重檢測深度等等）。

可以提高給定引物的性能嗎？ 稍微改動一下引物的序列可以提高 RPA 性能。任何給定的引物 都可以通過以下方法進(jìn)行優(yōu)化：以單核苷酸為基礎(chǔ)略微改變引物 的長度；以及保持引物長度不變，以 1bp 為增量移動引物的位 置。經(jīng)過改動的引物，需要重新進(jìn)行擴(kuò)增活性的測試。

怎樣才算是好引物？ 目前對于好引物還沒有確切的設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)，所以需要進(jìn)行篩選。

RPA 引物的解鏈溫度應(yīng)該是多少？

由于 RPA 反應(yīng)是在恒溫和 DNA 解鏈蛋白徹底改變 DNA 的解 鏈行為的條件下進(jìn)行的，因此傳統(tǒng)的估算的解鏈溫度不直接適用 于該系統(tǒng)。

我該如何選擇探針？

如果使用適用于探針的其中一種 TwistAmp? 試劑盒，請參照附 錄（網(wǎng)址為 twistdx.co.uk）中描述的有關(guān)檢測探針的設(shè)計指南。 需要注意的是，使用首選的 TwistAmp? exo 探針系統(tǒng)在標(biāo)靶區(qū) 域中選擇探針位置時，有一些序列限制。如果存在不合理的限 制，TwistDx 可幫助您設(shè)計備選檢測策略。備選的 TwistAmp? fpg 探針系統(tǒng)更容易提供靈活的探針設(shè)計，但它產(chǎn)生的熒光信號 有時不如 TwistAmp? exo   探針強(qiáng)。

引物需要進(jìn)行任何特別純化嗎？ 在進(jìn)行引物篩選的時候，通常不需要使用特別純化的寡核苷酸。 但與用于其他技術(shù)時一樣，我們注意到了引物制備質(zhì)量的 批間差異。因此，對于一致性要求比較嚴(yán)格的應(yīng)用，我們建議在 確定了好引物之后使用更純的引物。

經(jīng)過一種 TwistAmp?    試劑盒測試的引物，能直接用于其他

TwistAmp? 試劑盒么？

不一定。如果您已使用 TwistAmp? Basic 試劑盒設(shè)計了引物， 用于 TwistAmp? exo 或 nfo 試劑盒時您還需要引入探針。這個 和其他因素意味著跑膠檢測、熒光檢測或側(cè)流層析檢測對引物的 最佳組合可能有不同的要求。通常情況下，我們發(fā)現(xiàn)，使用相似

序列的探針從 TwistAmp? exo 熒光檢測轉(zhuǎn)為 TwistAmp? nfo 側(cè) 流層析檢測能夠獲得相當(dāng)可靠的結(jié)果。但是熒光檢測的最佳引 物/探針組合不一定是能夠提供最令人滿意跑膠檢測結(jié)果的引物 組合，反之亦然。從 DNA 檢測分析轉(zhuǎn)為 RNA 檢測的逆轉(zhuǎn)錄 分 析的情況更為復(fù)雜，因為逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶對引物有著不同的偏 好。就這一點(diǎn)而論，我們建議使用逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)在 RNA 模板上設(shè) 計 RNA   檢測，而不是在使用 DNA   試劑盒優(yōu)化后嘗試轉(zhuǎn)為使 用 RT  試劑盒。

能直接用標(biāo)記的引物和 TwistAmp? Basic 劑盒進(jìn)行側(cè)流層析檢 測嗎？ 可以。您可以根據(jù)需要使用兩個經(jīng)過修飾的引物來進(jìn)行側(cè)流層 析檢測，但我們推薦使用探針和 TwistAmp? nfo  試劑盒。這是 因為 RPA 與 PCR 一樣，會受到引物二聚體形成的影響。如 果引物設(shè)計不完美，引物很容易發(fā)生交叉反應(yīng)，生成假陽性結(jié) 果。TwistAmp? nfo  探針能夠避免這個問題，因為它們被封閉， 所以無法延伸形成探針-引物二聚體。nfo 酶只有在與互補(bǔ)鏈結(jié) 合時才能識別并切除無堿基位點(diǎn) (THF)。切除無堿基位點(diǎn)意味 著，探針的封閉端可以脫落，探針可以充當(dāng)引物，從而生成可被 側(cè)流層析試紙條檢測到的產(chǎn)物。因此，只有獲得所需的擴(kuò)增子， 探針才能結(jié)合、被切割并延伸以形成帶有反向標(biāo)記引物的產(chǎn)物。

RPA  支持生物素或熒光標(biāo)記的寡核苷酸嗎?

支持。在 RPA 反應(yīng)中，連有生物素或熒光團(tuán)的引物與未修飾的 引物表現(xiàn)差不多。我們還沒有發(fā)現(xiàn)任何差異。

 多重檢測                                                                                   

TwistAmp? 反應(yīng)能實(shí)現(xiàn)多重檢測嗎？ 可以。可以在同一個管中同時進(jìn)行多個擴(kuò)增反應(yīng)。不過，多重化 的引物對組合需要精心設(shè)計，以便每個引物對都能同樣有效地工 作。需要注意的是，反應(yīng)中的寡核苷酸總量 (nmol) 不要明顯 超出實(shí)驗方案中規(guī)定的量；如果在一個反應(yīng)中使用兩個以上的擴(kuò) 增引物，則應(yīng)在所有存在的寡核苷酸之間分配不同引物的最大用 量。另外，同時監(jiān)控多個擴(kuò)增事件也需要不同的探針；多重檢測 對檢測設(shè)備以及熒光團(tuán)兼容性的限制也必須予以考慮。

 定量                                                                                          

可以利用 TwistAmp? 反應(yīng)對模板定量嗎？ 可以。特定檢測的擴(kuò)增子達(dá)到可檢出水平的時間，取決于反應(yīng)起 始時的模板量：初始模板的拷貝越多，擴(kuò)增子就越快達(dá)到可檢 出水平。不過，利用這種“基于時間”的定量需要精心的實(shí)驗設(shè) 計，確保對照反應(yīng)是同時開始的（例如，可以通過“鎂離子的添 加”進(jìn)行控制）。相對“較慢”的擴(kuò)增反應(yīng)有助于更精確的定 量。減慢擴(kuò)增反應(yīng)速度的策略（包括合適引物的設(shè)計）在附錄（ 網(wǎng)址為 twistdx.co.uk）中討論。

 Twista  兼容性                                                                       

可以在 Windows 8  設(shè)備上運(yùn)行 Twista?  嗎？

Twista?  與 Windows 8  系統(tǒng)不兼容，因此您必須安裝 Windows

早期版本（XP  Vista  或 7）的仿真程序才能運(yùn)行 Twista。

 設(shè)置                                                                                          

試劑盒在運(yùn)輸時處于常溫，它還能使用嗎？ 可以，試劑盒處于常溫下 2-3 周不會有問題，仍然可以使用。 如果您不確定，請運(yùn)行對照測試并將結(jié)果發(fā)送給我們，我們將 能確定實(shí)際情況是不是這樣。對于長期貯存，我們建議貯存在

-20?C  下。

可以將再水化溶液的每一種成分直接依次添加到凍干的反應(yīng)球 團(tuán)中嗎？ 不可以。將一種引物或探針先于另一種加入體系將會導(dǎo)致重組復(fù) 合物的形成偏向先添加的寡核苷酸。這就是引物和探針必須同時 添加的原因。

可以將醋酸鎂添加到重懸緩沖液中嗎？

如果您在使用 TwistAmp? Basic、nfo 或 fpg 反應(yīng)體系，是可以 添加的。 不過一旦加入鎂離子，反應(yīng)組分就被激活。在最后用移液器將醋 酸鎂移取至反應(yīng)中時，我們建議可將醋酸鎂添加到聯(lián)排反應(yīng)管的 蓋子上并將其離心旋轉(zhuǎn)至反應(yīng)體系中，如此您便可確保反應(yīng)同時 開始，并將交叉污染或移液槍頭上殘留的任何反應(yīng)殘液生成 RPA 產(chǎn)物的風(fēng)險降至最低。

如果您在使用 TwistAmp? exo 或 TwistAmp? exo RT 反應(yīng)體系， 則不可以添加。在有鎂離子存在時，引物和探針在受到重組酶和 單鏈結(jié)合蛋白保護(hù)之前可能被核酸外切酶破壞。這可能會導(dǎo)致反 應(yīng)中出現(xiàn)很高的熒光基線。

可以制備預(yù)混液嗎？ 可以。如果您想建立多個反應(yīng)，可以制備預(yù)混液。在篩選不同的 DNA 時，可以將重懸緩沖液、引物和探針（如使用）混合在一 起，并加入到凍干的反應(yīng)物中進(jìn)行重懸。然后將不同 DNA 加入 反應(yīng)體系，最后照常用 MgAc 起始反應(yīng)。在進(jìn)行引物篩選時， 可以用重懸緩沖液、模板 DNA、探針（如果使用）和一個引物 制成預(yù)混液，并將其分裝到 1.5 ml 小管之后再分別加入不同的 引物。只有當(dāng)兩個引物都存在時，才能重懸凍干的反應(yīng)物，否則 會使重組復(fù)合物的形成偏向先添加的寡核苷酸。

 運(yùn)行 RPA  反應(yīng)                                                                       

TwistAmp?      試劑盒應(yīng)在怎樣的溫度下使用？

標(biāo)準(zhǔn)的 TwistAmp? 試劑盒經(jīng)過配置可在 37°C-42°C 的溫度范圍 內(nèi)操作。過高的溫度會對反應(yīng)體系產(chǎn)生不利的影響，因為酶會逐 漸地失去全部活性。在適當(dāng)?shù)臈l件下，RPA 過程本身可以在較 低的溫度下進(jìn)行，但所提供的 TwistAmp? 試劑盒的制劑已針對 高反應(yīng)動力學(xué)速度進(jìn)行了優(yōu)化，通常不兼容使用低于推薦范圍的 溫度條件的檢測方案。對于 RT 試劑盒，我們建議用戶在 40°C 下運(yùn)行反應(yīng)，因為逆轉(zhuǎn)錄酶在稍高的溫度下具有更高的活性。

如果要運(yùn)行 TwistAmp?  反應(yīng)，必須使用 Twista?  嗎？  不需要。 TwistAmp? Basic 和 nfo 試劑盒適用于任何能夠保持 37-42°C 的穩(wěn)定溫度的設(shè)備。對于使用 TwistAmp? exo 試劑盒 進(jìn)行的實(shí)時反應(yīng)，可使用能激發(fā)并檢測所用熒光發(fā)色團(tuán)并能保持 37-42°C 穩(wěn)定溫度的任何孔板檢測儀或?qū)崟r熱循環(huán)儀。注意，在 運(yùn)行 RPA  反應(yīng)時，蓋加熱功能應(yīng)關(guān)閉。

可以使用 TwistAmp? Basic 反應(yīng)的擴(kuò)增子進(jìn)行 TA 克隆嗎？ TwistAmp? Basic 反應(yīng)中使用的聚合酶不具有編輯功能，擴(kuò)增子 應(yīng)該是可以用于 TA  克隆的。不過，我們尚未對此進(jìn)行過測試。

可以在反應(yīng)體系中加入更多/更少的再水化緩沖液嗎？ 不可以。加入比建議量更多或更少的再水化緩沖液會對 RPA 反 應(yīng)的進(jìn)行方式產(chǎn)生不利影響。緩沖液中包含 RPA 反應(yīng)所需的成 分，因此加入更多或更少的緩沖液將會改變其在重懸球團(tuán)中的最 終濃度。

 檢測                                                                                          

可以對擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行熒光終點(diǎn)分析嗎？

可以，但不包括使用 TwistAmp? exo 試劑盒或 exo RT 試劑盒的 情況。因為在擴(kuò)增停止后，反應(yīng)混合物中的核酸外切酶會消化掉 大部分的擴(kuò)增產(chǎn)物。要分析擴(kuò)增子，請使用 TwistAmp? Basic 試 劑盒。也可以對使用 TwistAmp?nfo 和 TwistAmp? fpg 試劑盒 生成的產(chǎn)物跑膠分析。注意，如果您想對這些產(chǎn)物進(jìn)行跑膠分 析，可將 TwistAmp?nfo 試劑盒與 TwistAmp? exo 探針結(jié)合使 用，但反應(yīng)動力學(xué)速度會變慢。

可以使用插入性染色劑 實(shí)時監(jiān)控TwistAmp?  嗎？ 可以。插入性染色劑可以在 TwistAmp? 反應(yīng)中進(jìn)行定量和監(jiān) 控。不過，就像 PCR 一樣，這種染料通常可以結(jié)合到任何雙鏈 DNA 上，因此引物噪音會產(chǎn)生假陽性信號。引物噪音在較低的 溫度下會更嚴(yán)重一些，而在 PCR 檢測中，測量插入性染料時的 溫度通常是引物二聚體熔解時的溫度。此外，TwistAmp? exo  試 劑盒中的核酸外切酶會在反應(yīng)過程中消化大部分的擴(kuò)增產(chǎn)物，因 此不推薦將插入性染料用于這類試劑盒。

跑膠之前需要回收 RPA  產(chǎn)物嗎？

需要。RPA 反應(yīng)體系里的集聚試劑和蛋白會干擾正常的瓊脂糖 凝膠電泳，如果不進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物回收，跑出來的可能是彌散條帶 而不是干凈的條帶。

在用側(cè)流層析試紙進(jìn)行檢測之前需要稀釋 RPA 產(chǎn)物嗎？ 需要。RPA 反應(yīng)體系里的集聚試劑和蛋白會干擾側(cè)流層析試紙 上的抗體，如果不進(jìn)行充分稀釋就會出現(xiàn)非特異性結(jié)合和假陽 性信號。

在 TwistAmp? exo (RT) 反應(yīng)即將結(jié)束時，有時會看到熒光急劇 增強(qiáng)，這正常嗎？

正常。在 TwistAmp? exo 反應(yīng)中，聚合酶和核酸外切酶 III 處 于競爭關(guān)系。隨著反應(yīng)的能量逐漸耗盡，核酸外切酶 III 開始 占據(jù)優(yōu)勢，結(jié)果導(dǎo)致探針更快速地裂解和熒光信號出現(xiàn)劇增。

可以保存 TwistAmp?    反應(yīng)產(chǎn)生的擴(kuò)增子嗎？

可以，TwistAmp? Basic  或 nfo  反應(yīng)體系的擴(kuò)增子短期可以保存 在 4°C  下，長期保存在 -20°C   下。

TwistAmp? exo (RT) 反應(yīng)的擴(kuò)增子不能保存。如果在反應(yīng)停止后 未經(jīng)迅速的失活處理，核酸外切酶 III 很可能會消化擴(kuò)增子。