概念：概括地說(shuō)，轉(zhuǎn)染是使用非病毒感染的手段人工引入核酸（DNA或RNA）進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程。轉(zhuǎn)染的目的是產(chǎn)生重組蛋白，或特異性增強(qiáng)或抑制轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的基因表達(dá)。

轉(zhuǎn)染的類型

根據(jù)導(dǎo)入的核酸存在于宿主細(xì)胞的時(shí)間長(zhǎng)短，可以分為瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn)。根據(jù)轉(zhuǎn)染方式可以分為化學(xué)，生物，物理方法。

瞬轉(zhuǎn)：因?yàn)閷?dǎo)入的核酸沒(méi)有整合到宿主細(xì)胞基因組，因此它只會(huì)短暫地存在于宿主細(xì)胞中，不會(huì)隨著細(xì)胞的分裂而進(jìn)入到子代細(xì)胞中。然而，導(dǎo)入的遺傳物質(zhì)的高拷貝數(shù)導(dǎo)致其在細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平較高。根據(jù)所使用的載體的不同，瞬轉(zhuǎn)通常可以1至7天內(nèi)進(jìn)行基因檢測(cè)，但是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞通常在轉(zhuǎn)染后24-96小時(shí)收獲。當(dāng)使用超螺旋質(zhì)粒DNA時(shí)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的效果最好，推測(cè)是由于超螺旋質(zhì)粒DNA能更有效地被細(xì)胞攝取。

穩(wěn)轉(zhuǎn)：外源DNA整合到細(xì)胞基因組中或作為附加體質(zhì)粒保留在細(xì)胞中。與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染不同，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染允許外源DNA在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞及其后代中的長(zhǎng)期維持。然而，通常是將單拷貝或幾個(gè)拷貝的外源DNA整合到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的基因組中，因此，其表達(dá)水平一般低于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)水平。

由于穩(wěn)轉(zhuǎn)效率較低，因此選用有效地轉(zhuǎn)染策略和篩選方法很重要。其中比較可靠地篩選方法是在DNA載體中包含選擇性標(biāo)記，然后在細(xì)胞轉(zhuǎn)染短暫性恢復(fù)后進(jìn)行適當(dāng)?shù)剡x擇性加壓。盡管相對(duì)于超螺旋DNA，線性DNA被細(xì)胞攝取的效率較低，但其能最有效地整合到宿主基因組中。

目前，由于各種轉(zhuǎn)染試劑的發(fā)明，哺乳動(dòng)物細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染已經(jīng)用于生產(chǎn)具有適當(dāng)折疊和翻譯后修飾的重組蛋白。但表達(dá)mg/L-g/L的重組蛋白主要依賴于穩(wěn)定細(xì)胞系的產(chǎn)生。

瞬轉(zhuǎn)和穩(wěn)轉(zhuǎn)的比較

轉(zhuǎn)染方式

細(xì)胞由帶負(fù)電荷的磷脂雙分子層構(gòu)成，這對(duì)大分子物質(zhì)來(lái)說(shuō)是個(gè)不可透過(guò)的屏障，比如DNA和RNA的磷酸骨架，其也帶負(fù)電荷。為了使核酸穿過(guò)細(xì)胞膜，研究人員開(kāi)發(fā)了多種技術(shù)，大致分為三類：化學(xué)方法---利用載體分子包被核酸使其呈現(xiàn)中性電荷或正電荷。生物方法---利用基因工程病毒轉(zhuǎn)染非病毒基因到細(xì)胞中。物理方法---在細(xì)胞膜表面產(chǎn)生一個(gè)瞬時(shí)的孔從而導(dǎo)入DNA。然而，沒(méi)有一種方法適用于所有的細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)，理想的方法應(yīng)根據(jù)您的細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行選擇，理想的方法應(yīng)具有高轉(zhuǎn)染效率，低細(xì)胞毒性和對(duì)正常生理學(xué)的影響最小，并且易于使用和可重復(fù)性等特點(diǎn)。

陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染

原理：陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染是目前最常用的轉(zhuǎn)染方式之一。陽(yáng)離子脂質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)由帶正電荷的頭基和一個(gè)或兩個(gè)烴鏈組成，帶正電荷的頭基與帶負(fù)電荷的核酸通過(guò)靜電作用形成復(fù)合物，經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。LifeTechnologies?提供了廣泛的陽(yáng)離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染試劑，用于有效地將DNA，RNA，siRNA或寡核苷酸引入廣泛的細(xì)胞類型，包括Lipofectamine?3000試劑。當(dāng)選擇轉(zhuǎn)染試劑時(shí)，您必須考慮您希望導(dǎo)入（DNA，RNA或蛋白質(zhì)）的有效載荷以及要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型，因?yàn)檗D(zhuǎn)染試劑的選擇強(qiáng)烈影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)步驟：將DNA，RNA，siRNA或寡核苷酸和轉(zhuǎn)染試劑分別在不同的管中稀釋→將兩者混合形成混合物→將形成的混合物加入細(xì)胞中，脂質(zhì)體的正電荷有助于幫助復(fù)合物粘附到細(xì)胞膜上→復(fù)合物經(jīng)細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞→檢測(cè)基因表達(dá)或沉默情況。

磷酸鈣共沉淀

原理：將DNA與氯化鈣在磷酸緩沖鹽水中混合形成磷酸鈣-DNA沉淀物，然后將其分散在培養(yǎng)的細(xì)胞上，磷酸鈣促進(jìn)共沉淀物中的縮合DNA與細(xì)胞表面的結(jié)合，DNA通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)步驟：將氯化鈣和DNA混合，以可控的方式加入磷酸緩沖液。→在室溫下孵育，以形成極細(xì)，可溶的共沉淀微粒→將磷酸鈣-DNA沉淀物加入細(xì)胞中，后者能黏附到細(xì)胞膜表面→共沉淀物經(jīng)細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞→檢測(cè)基因表達(dá)或沉默情況。

病毒轉(zhuǎn)染

原理：對(duì)于用脂質(zhì)體不能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，可以采用病毒轉(zhuǎn)染。腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體已廣泛用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi)外的基因轉(zhuǎn)染。

實(shí)驗(yàn)步驟：通過(guò)基因克隆方法獲得重組病毒表達(dá)載體→轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系，擴(kuò)增并分離得到重組病毒顆粒→純化并滴定病毒液→轉(zhuǎn)導(dǎo)目的細(xì)胞（含有病毒特異性的受體）→從培養(yǎng)基中移除病毒→檢測(cè)基因表達(dá)或沉默情況。

電轉(zhuǎn)

原理：利用電脈沖在細(xì)胞膜上形成暫時(shí)的孔使核酸物質(zhì)能穿過(guò)孔進(jìn)入細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)步驟：利用電轉(zhuǎn)緩沖液重懸細(xì)胞→對(duì)含有核酸，緩沖液，細(xì)胞的混合物給予合適的電脈沖→電脈沖在細(xì)胞膜上形成電勢(shì)差，誘導(dǎo)產(chǎn)生暫時(shí)的孔使核酸進(jìn)入細(xì)胞→將細(xì)胞返回到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，使其慢慢恢復(fù)→檢測(cè)基因表達(dá)或沉默情況。